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　　 线粒体是真核细胞内一种重要和独特的细胞器。人体内的细胞每天要合成几公斤的ATP，且95％ATP是由线粒体中的呼吸链所产生，因此，线粒体被称为细胞内的“能量工厂”（Power plants）。线粒体通过氧化磷酸化作用，进行能量转换，提供细胞进行各种生命活动所需要的能量。1890年，德国生物学家Altmann 首先在光学显微镜下观察到动物细胞内存在着一种颗粒状的结构，称作生命小体（bioblast）。1897年 Benda重复了以上实验，并将之命名为线粒体（mitochondrion，源于希腊字mito：线，chondrion：颗粒）。1904年Meves在植物细胞中也发现了线粒体，从而确认线粒体是普遍存在于真核生物所有细胞中的一种重要细胞器。1900年Michaelis用詹纳斯绿B（Janus green B）对线粒体进行活体染色，并证实了线粒体可进行氧化还原反应。1912年Kingsbury第一个提出线粒体是细胞内氧化还原反应的场所。1913年Engelhardt证明磷酸化和氧的消耗偶联在一起。1943-1950年，Kennedy和Lehninger进一步证明，柠檬酸循环、氧化磷酸化和脂肪酸氧化均发生在线粒体内。其后，Lehninger 又发现氧化磷酸化需要电子传递。19521953年，Palade和Sjostrand各自利用电镜技术观察到线粒体的精细结构。1963-1964年又确定线粒体内有DNA存在。从而在分子水平上对线粒体的结构及其功能有了较全面而深入的认识。

线粒体
Mitochondrion

 

 

 

 

 
线粒体的形态、大小、数量和分布
   

线粒体（mitochondrion）是真核细胞中由双层高度特化的单位膜围成的细胞器，主要功能是通过氧化磷酸化作用合成ATP，为细胞各种生理活动提供能量，其超微结构由内外两层膜封闭组成，包括外膜（outer membrane）、内膜（inner membrane）、膜间隙（intermembrane space）及基质（matrix）4个部分
   

线粒体的形态、大小、数量与分布，在不同细胞内变动很大，就是同一细胞在不同生理状态下也不一样。线粒体在生活细胞中具有多形性、易变性、运动性和适应性等特点。其形状多种多样，但以线状和颗粒状最常见，也可呈环形、哑铃形、分枝状或其它形状。 在一定条件下线粒体的形状变化是可逆的，线粒体一般直径为0.5～1.0μm，长1.5～3.0μm。其大小也因细胞种类和生理状况的不同而不一样。例如，大鼠肝细胞的线粒体可长达5μm。在胰腺的外分泌细胞中可观察到巨大线粒体，其长达10～20μm。人的成纤维细胞线粒体甚至可长达40μm。线粒体的形状与大小并不是固定的，而是随着代谢条件的不同而改变，它可能反映线粒体处于不同的代谢状态。一般动物细胞内线粒体的数目由数百到数千个，肝细胞内约有1 700个左右。植物细胞的线粒体数量一般较动物细胞的少。线粒体的数目在不同类型细胞内有很大差别，许多哺乳动物成熟的红细胞缺少线粒体，利什曼原虫中只有一个巨大的线粒体，海胆卵母细胞则多达30万个，巨大变形虫可高达50万个。线粒体的数目还与细胞的生理功能及生理状态有关，在新陈代谢旺盛的细胞中线粒体多，如人和哺乳动物的心肌、小肠、肝等内脏细胞中线粒体很丰富；飞翔鸟类胸肌细胞线粒体的数目比不飞翔鸟类的多；运动员的肌细胞线粒体比不常运动的人多。线粒体在细胞内的分布一般是不均匀的，例如，肠上皮细胞中的线粒体呈两极性分布，集中于顶部和基部。根据细胞代谢的需要，线粒体可在细胞质中运动、变形和分裂增殖，如在玉米的小孢子发育过程中，线粒体定向的运动、聚集与分散，在此过程中绒毡层细胞中线粒体的数量可增加40多倍。线粒体往往在细胞代谢旺盛的需能部位比较集中，如分泌细胞的线粒体聚集在分泌物合成的区域；肌细胞的线粒体沿肌原纤维规则排列；精子细胞的线粒体集中在鞭毛中区。线粒体的这种分布显然有利于需能部位的能量供应。线粒体在细胞质中迁移时，往往与微管有关。

线粒体的超微结构
在电镜下观察到线粒体是由两层单位膜套叠而成的封闭的囊状结构。主要由外膜（outer membrane）、内膜（inner membrane）、膜间隙（intermembrane space）及基质（matrix）或内室（inner chamber）4部分组成。外膜是包围在线粒体最外面的一层单位膜，光滑而有弹性，厚约6nm。用磷钨酸负染时，可观察到外膜上有排列整齐的筒状圆柱体，高5～6nm，直径6nm，其成分为孔蛋白（porin），圆柱体上有直径为2～3nm的小孔。相对分子量为1.0×104以下的小分子物质均可通过小孔进入膜间隙。内膜位于外膜内侧，把膜间隙与基质（内室）分开，厚约6～8nm。内膜对物质的通透性很低，能严格地控制分子和离子通过，这种“不透性”（impermeability）在ATP的生成过程中起重要作用。这种特性与内膜的结构组成有关，内膜含有大量的心磷脂（Cadiolipin），形成通透性屏障，如H+、ATP、丙酮酸等不能自由透过内膜，必须在载体或通透酶（permease）系统的协助下才能实现跨膜运输。内膜向线粒体内室褶叠形成嵴（cristae）。嵴使内膜的表面积大大扩增，有人估计，大鼠肝细胞线粒体嵴的表面积比外膜大4倍，这对线粒体进行高速率的生化反应是极为重要的。嵴的形状和数量与细胞种类及生理状况密切相关，需能多的细胞，不但线粒体多，嵴的数量也多。嵴有两种类型：板层状和管状，其它形式的嵴可视为由这两种基本形式衍生而来。在高等动物，绝大部分细胞中线粒体的嵴为板层状，其方向与线粒体长轴垂直，但也有与长轴平行的，如神经细胞，而人的白细胞线粒体的嵴则为分支管状。用电镜负染色法观察分离的线粒体时，可见内膜和嵴的基质面上有许多排列规则的带柄的球状小体，称为基粒（elementary particle）。估计每个线粒体约有104～105个基粒。基粒由头部和基部组成。头部又称F1，为球形直径9nm的颗粒。基部又称F0，嵌入线粒体内膜。膜间隙是内外膜之间封闭的腔隙，宽约6～8nm，其中充满无定形液体，内含许多可溶性酶、底物和辅助因子。嵴内间隙（intracristal space）与膜间隙相通，实际上是膜间隙的延伸。基质为内膜所包围的嵴外空间，腔内充满可溶性蛋白质性质的胶状物质，呈均质状，具有一定的pH值和渗透压。

线粒体的化学组成及酶的定位
线粒体的化学成分主要是蛋白质和脂类。其中蛋白质占线粒体干重的65～70％，脂类占25～30％。大鼠肝细胞线粒体蛋白质的67％在基质内，21％在内膜，6％在外膜，6％在膜间隙。线粒体的蛋白质可分为可溶性与不溶性两类。可溶性蛋白大多数是基质中的酶和膜的外周蛋白；不溶性蛋白是膜的镶嵌蛋白、结构蛋白和部分酶蛋白。肝细胞线粒体蛋白质有50～70％是可溶的，而牛心肌线粒体中只有15％是可溶的，这与嵴的多少有关。用电泳方法分析，线粒体外膜上含有14种蛋白质，内膜上含有21种蛋白质。线粒体的脂类主要成分是磷脂，占3/4以上。其中含卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、心磷脂和少量肌醇及胆固醇等。磷脂在内外膜上的组成不同，外膜上主要是卵磷脂，其次是磷脂酰乙醇胺，磷脂酰肌醇和胆固醇的含量较少。内膜主要含心磷脂，高达20％，比任何膜的都高，但胆固醇含量极低，这与内膜的高度疏水性有关。线粒体内、外膜在化学组成上的根本区别是脂类和蛋白质的比值不同，内膜的脂类与蛋白质的比值低（0.3∶1），外膜的比值较高（1∶1）。内膜富含酶蛋白和辅酶，外膜仅含少量酶蛋白。线粒体的基质中含有催化三羧酸循环、脂肪酸β-氧化、氨基酸氧化、蛋白质合成等有关的上百种酶和一些有形成分，如环状DNA、RNA、核糖体及较大的致密颗粒，这些颗粒是含磷酸钙的沉积物，其作用是贮存钙离子，也可结合镁离子。基质中还有许多可溶性代谢中间产物。线粒体约有140余种酶，分布在各个结构组分中，其中37％是氧化还原酶，10％是合成酶，水解酶不到9％，标志酶约30种。线粒体各组成部分所含的酶是不同的，这与各部分的功能有关。在这些酶中，有的可作为某一部位所特有的标志酶。如外膜的单胺氧化酶，膜间隙的腺苷酸激酶，内膜的细胞色素氧化酶，基质中的苹果酸脱氢酶。
 
线粒体的功能
线粒体的主要功能是进行氧化磷酸化，合成ATP，为细胞生命活动提供直接能量。线粒体是糖、脂肪和氨基酸最终氧化释能的场所。糖和脂肪等营养物质在细胞质中经过降解作用产生丙酮酸和脂肪酸，这些物质进入线粒体基质中，再经过一系列分解代谢形成乙酰CoA，即可进一步参加三羧酸循环。三羧酸循环中脱下的氢经线粒体内膜上的电子传递链（呼吸链），最后传递给氧，生成水。在此过程中释放的能量，通过ADP的磷酸化，生成高能化合物ATP，供机体各种活动的需要。因此氧化磷酸化是细胞获得能量的主要途径。因而，细胞内线粒体存在的状况往往反映细胞对能量的需要。实验证明，把酵母转至无氧条件下培养，线粒体的数目会减少，大量的嵴会消失，同时，几乎所有的细胞色素分子消失，线粒体变为很小的无功能的囊泡。如果重新给这些酵母供氧，线粒体又能生成嵴，恢复正常形态，且数量也增加，同时细胞色素也能重新合成，此时细胞活跃增殖。线粒体的功能不仅是为细胞提供ATP能量，而且还与细胞中氧自由基的生成、细胞程序性死亡、细胞的信号转导、细胞内多种离子的跨膜转运及电解质稳态平衡的调控包括线粒体对细胞中Ca2＋的稳态调节等有关。
 

ATP（adenosine-triphosphate）是腺嘌呤核苷三磷酸的简称，又叫三磷酸腺苷（腺苷三磷酸），其中A表示腺苷（由腺嘌呤和核糖组成），T表示其数量为三个，P表示磷酸基团，即一个腺苷上连接三个磷酸基团
 

ATP是由一分子腺嘌呤、一分子核糖和三个相连的磷酸基团构成的，其结构简式为：A―P～P～P，其中A其相邻的两个磷酸基之间的化学键非常活跃，水解时可释放约30.54kJ/mol的能量，因此称为高能磷酸键，用“～”表示
 

ATP远离腺苷的一个高能磷酸键易断裂，释放出一个磷酸和能量后成为腺苷二磷酸（ADP）。在有机物氧化分解或光合作用过程中，ADP可获取能量，与磷酸结合形成ATP。ATP和ADP这种相互转化，是时刻不停的发生且处于动态平衡之中的
 
电子传递链（呼吸链）
氧化（放能）和磷酸化（贮能）是同时进行并密切偶联在一起的，但却是由两个不同的结构系统实现的。1968年E.Racker等人用超声波将线粒体破碎，线粒体内膜碎片可自然卷成颗粒朝外的小膜泡，这种小膜泡称为亚线粒体小泡（submitochondrial vesicle）或亚线粒体颗粒（submitochondrial particles）。这些亚线粒体小泡具有电子传递和磷酸化的功能。如用胰蛋白酶或尿素处理，则小泡外面的颗粒可解离下来，这样的小泡便只能进行电子传递，而不能使ADP磷酸化生成ATP。如果将这些颗粒重新组装到无颗粒的小泡上时，则小泡又恢复了电子传递和磷酸化相偶联的能力。由此可见，由NADH脱氢酶至细胞色素氧化酶的整个呼吸链的各种组分均存在于线粒体内膜中，而颗粒是氧化磷酸化的偶联因子，位于内膜的基质侧，它是基粒（ATP酶复合物）的组分之一。在线粒体内膜上存在有关氧化磷酸化的脂蛋白复合物，它们是传递电子的酶体系，由一系列能可逆地接受和释放电子或H+的化学物质所组成，在内膜上相互关联地有序排列，称为电子传递链（electron-transport chain）或呼吸链（respiratory chain）。目前普遍认为细胞内有两条典型的呼吸链，即NADH呼吸链和FADH2呼吸链。这是根据接受代谢物上脱下的氢的原初受体不同而区分的。线粒体内膜上的呼吸链是典型的多酶氧化还原体系，由多个组分组成。参加呼吸链的氧化还原酶有：（1）烟酰胺脱氢酶类（以NAD+或NADP+为辅酶）；（2）黄素脱氢酶类（以黄素单核苷酸FMN或黄素腺嘌呤二核苷酸FAD为辅基）；（3）铁硫蛋白类（或称铁硫中心，FeS），分子中含非血红素铁和对酸不稳定的硫，其作用是通过铁的化合价的互变进行电子传递；（4）辅酶Q类，是一种脂溶性的醌类化合物，它具有3种不同的氧化还原状态，即氧化态Ｑ、还原态QH2和介于两者之间的半醌QH；（5）细胞色素类，是一类以铁卟啉为辅基的色蛋白，其主要功能是通过铁的化合价的互变传递电子。目前发现的细胞色素有a、a3、b、c、c1等。在aa3分子中，除含血红素铁外，尚含有2个铜原子，依靠其化合价的变化，把电子从a3传递到氧。Green等人首先将呼吸链拆离成4种功能复合物（I～IV）以及辅酶Q和细胞色素c。4种复合物包埋在线粒体内膜中，辅酶Q和细胞色素c是呼吸链中可流动的递氢体或递电子体。复合物Ⅰ：是NADH-CoQ还原酶，又称NADH脱氢酶，由25条以上多肽链组成，总相对分子量为8.5×105，以二聚体的形式存在。每个单体含有一个黄素单核苷酸（FMN） 和至少6个铁硫蛋白。它是呼吸链中最大最复杂的酶复合物，其作用是催化NADH的2个电子传给辅酶Q，同时发生质子的跨膜输送，故复合物Ⅰ既是电子传递体又是质子移位体。复合物Ⅱ：是琥珀酸-CoQ还原酶，又称琥珀酸脱氢酶，由4条多肽链组成，总相对分子量为1.4×105，含有一个共价结合的黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）、2个铁硫蛋白和一个细胞色素b。 其作用是催化电子从琥珀酸通过FAD和铁硫蛋白传给辅酶Q。复合物Ⅱ不能使质子跨膜移位。复合物Ⅲ：是CoQ-细胞色素c还原酶，由10条多肽链组成，总相对分子量为2.5×105，以二聚体的形式存在。每个单体含有2个细胞色素b（b562，b566）、一个细胞色素c1和一个铁硫蛋白。其作用是催化电子从辅酶Q传给细胞色素c，同时发生质子的跨膜输送，故复合物Ⅲ既是电子传递体，又是质子移位体。复合物Ⅳ：是细胞色素氧化酶，由6～13条多肽链组成，总相对分子量约为1.6×105，以二聚体的形式存在。每个单体含有细胞色素a和a3及2个铜原子（CuA，CuB）。其作用是催化电子从细胞色素c传给氧。同时发生质子的跨膜输送，故复合物Ⅳ既是电子传递体又是质子移位体。呼吸链的各组分在内膜上的含量比不同，不同种类细胞中线粒体的这种比例也不相同。大致比例为：复合物Ⅰ∶Ⅲ∶Ⅳ=1∶3∶7。四种复合物在电子传递过程中协同作用。复合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ组成主要的NADH呼吸链，催化NADH 的氧化；复合物NⅡ、Ⅲ、Ⅳ组成FADH2呼吸链，催化琥珀酸的氧化。实验证明，呼吸链各组分有严格的排列顺序和方向。从NADH 到分子氧之间的电子传递过程中，电子是按氧化还原电位从低向高传递。NAD+/NADH 的氧化还原电位值最低 （E'0＝－0.32V），O2/H2O的氧化还原电位值最高（E'0＝+0.82V）。 根据实验测定的呼吸链各组分的氧化还原电位值确定其排列顺序，因为各组分在链上的顺序与其得失电子的趋势有关，电子总是从低氧化还原电位向高氧化还原电位流动。氧化还原电位值愈低的组分供电子的倾向愈大，愈易成为还原剂而处于传递链的前面。通过利用呼吸抑制剂（鱼藤酮，抗霉菌素A，CN-或CO等）阻断电子传递的实验也可以帮助确定传递链各组分排列顺序。
 

柠檬酸循环（citric acid cycle）又称三羧酸循环（tricarboxylic acid cycle），简写作TCA循环或Krebs循环，是体内糖类、脂肪或氨基酸有氧氧化的主要过程，通过生成的乙酰辅酶A与草酰乙酸缩合生成三羧酸（柠檬酸）开始，再通过一系列氧化步骤产生CO2、NADH及FADH2，最后仍生成草酰乙酸，进行再循环，从而为细胞提供了降解乙酰基而提供产生能量的基础
 

在线粒体内膜上存在有关氧化磷酸化的脂蛋白复合物，它们是传递电子的酶体系，由一系列能可逆地接受和释放电子或H+的化学物质所组成，在内膜上相互关联地有序排列，称为电子传递链（electron-transport chain）或呼吸链（respiratory chain），大致分为NADH-Q还原酶、琥珀酸-Q还原酶、细胞色素还原酶和细胞色素氧化酶等4部分
 

ATP合成酶（ATP synthetase）或F1F0-ATP酶广泛存在于线粒体、叶绿体、异养菌和光合细菌中，是生物体能量转换的核心酶，分别位于线粒体内膜，类囊体膜或质膜上，参与氧化磷酸化和光合磷酸化，在跨膜质子动力势的推动下催化合成ATP， 分子结构由突出于膜外的F1头部和嵌于膜内的F0基部两部分组成 ，它可能是已发现的自然界最小的分子马达，其运转效率几乎达100％
 
ATP合成酶的分子结构与组成
ATP合成酶（ATP synthetase）或F1F0-ATP酶广泛存在于线粒体、叶绿体、异养菌和光合细菌中，是生物体能量转换的核心酶。该酶分别位于线粒体内膜，类囊体膜或质膜上，参与氧化磷酸化和光合磷酸化，在跨膜质子动力势的推动下催化合成ATP。如果将ATP比喻为细胞内的能量货币，ATP合成酶则应比喻为制作货币的“印钞机”，因为ATP合成最终是在ATP合成酶催化下完成的。由此看出，ATP合成酶是线粒体氧化磷酸化和叶绿体光合磷酸化偶联的关键装置，也是合成能源物质ATP的关键装置。不同来源的ATP合成酶基本上有相同的亚基组成和结构，都是由多亚基装配形成的。其分子结构由突出于膜外的F1头部和嵌于膜内的F0基部两部分组成。F1（偶联因子F1）：为水溶性球蛋白，从内膜突出于基质内，较易从膜上脱落。牛心线粒体ATP酶的F1部分（F1-ATPase）相对分子量为3.71×105，由3α、3β、1γ、1δ和1ε等9个亚基组成，其中每一个α、β、γ、δ、ε亚基的氨基酸残基数分别为510、482、272、126和50。根据0.28? 分辩率的X-射线晶体衍射分析证实，3个α亚基和3个β亚基交替排列，形成一个 “桔瓣”状结构，各亚基分离时无酶活性，结合时有酶活性。α和β亚基上均具有核苷酸结合位点，其中β亚基的结合位点具有催化ATP合成或水解的活性。动物线粒体F1还有抑制蛋白（inhibitor protein），抑制蛋白专一地抑制F1-ATP酶的活力，在正常条件下可能起生理调节作用，即有调节酶活性的功能，但不抑制ATP合成。γ与ε亚基有很强的亲和力，结合在一起形成“转子”（rotor），位于α3β3的中央共同旋转以调节三个β亚基催化位点的开放和关闭。ε亚基有抑制酶水解ATP的活性，同时还有堵塞H+通道、减少H+泄漏的功能。F0（偶联因子F0）：是嵌合在内膜上的疏水蛋白复合体，形在一个跨膜质子通道。F0的亚基类型和组成在不同物种中差别很大，在细菌中，F0由a、b、c 3种亚基组成；蓝藻中为a、b、b’、c亚基；在叶绿体内与之相对应的是Ⅳ、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 4种亚基；线粒体内的F0更为复杂。F0各亚基的数量关系只有细菌的被确定为a1b2c10～12 。电镜观察显示，多拷贝的C亚基形成一个环状结构，a亚基与b亚基二聚体排列在C亚基12聚体形成的环的外侧，a亚基、b亚基二聚体和δ亚基共同组成“定子”（stator）。F0其中的一个亚基可结合寡霉素，通过该亚基可调节通过F0的H+流，如当质子动力势很小时，它可防止ATP水解；又可起到保护自身和抵抗外界环境变化的作用。F1和F0通过 “转子”和 “定子”将两部分连接起来，在合成或水解ATP的过程中，“转子”在通过F0的H+流推动下旋转，依次与3个β亚基作用，调节β亚基催化位点的构象变化；“定子”在一侧将α3β3与F0连接起来。F0的作用之一，就是将跨膜质子动力势转换成扭力矩（torgue），推动“转子”旋转。呼吸链的各组分和ATP合成酶在线粒体内膜上的分布是不对称的，数量也不相等。例如，心肌线粒体中，ATP合成酶∶ 复合物Ⅲ∶ 细胞色素c∶ 复合物Ⅳ＝1∶1∶2∶2。呼吸链的各组分和ATP合成酶约占内膜蛋白质的32～40％，其中ATP合成酶约占15％。
 
氧化磷酸化作用与电子传递的偶联
氧化还原的本质是电子的转移。氢原子的转移其本质也是电子转移，因为H原子可分解为H+与e-。当电子从NADH或FADH2经呼吸链传递给氧形成水时，同时伴有ADP磷酸化形成ATP，这一过程称为氧化磷酸化。氧化磷酸化是生成ATP的一种主要方式，是细胞内能量转换的主要环节。实验证明，呼吸链中有3个部位的自由能变化较大，这3个部位是呼吸链中氧化还原释放的能量与ADP磷酸化生成ATP的偶联部位，也即是呼吸链上可被特异性抑制剂阻断的部位。NADH呼吸链生成ATP的三个部位是：（1）NADH至辅酶Q；（2）细胞色素b至细胞色素c；（3）细胞色素aa3至氧之间。3处各生成一分子ATP，共生成3个ATP分子。但FADH2呼吸链只生成2个ATP分子，这是因为电子从FADH2至辅酶Q间传递所释放的能量不足以形成高能磷酸键所致。
 
氧化磷酸化的偶联机制
氧化磷酸化的偶联机制一直是研究氧化磷酸化作用的关键，也是大家最关注的中心问题。二十多年来提出了各种假说，主要有：化学偶联假说（chemical coupling hypothesis）、构象偶联假说 （conformational coupling hypothesis）、化学渗透假说（ chemiosmotic coupling hypothesis）等。现在越来越多的实验证明：偶联机制在生化上来说是向量的，在功能上来说是渗透性的。所以化学渗透假说己成为氧化磷酸化机制研究中最为流行的一种假说。该假说是1961年英国生物化学家Mitchell提出来的，他因此获得了1978年诺贝尔化学奖。化学渗透假说的主要内容是：呼吸链的各组分在线粒体内膜中的分布是不对称的，当高能电子在膜中沿呼吸链传递时，所释放的能量将H+ 从内膜基质侧泵至膜间隙，由于膜对H+ 是不通透的，从而使膜间隙的H+ 浓度高于基质，因而在内膜的两侧形成电化学质子梯度（electro-chemical proton gradient，△μH+），也称为质子动力势（proton motive force，△P）。在这个梯度驱动下，H+ 穿过内膜上的ATP合成酶流回到基质，其能量促使ADP和Pi合成ATP。质子动力势（△P）由两部分组成：一是膜内外H+ 浓度差（△pH），二是膜电位（△Ψ）。△P与△pH和△Ψ的关系如下：△P＝△Ψ－2.3（RT／F）△pH。式中R为气体常数，T为绝对温度，F为法拉第（Faraday）常数。质子动力势△P的单位为mV，电化学质子梯度△μH+ 的单位为焦耳/摩尔。综上所述，可以把线粒体内膜中的呼吸链看作是质子泵，在电子经呼吸链传递给氧的过程中，可把基质中的H+ 泵至膜间隙。 其反应过程是：呼吸链从NADH开始，它提供2个电子和1对H+ 传递给NADH脱氢酶上的黄素单核苷酸（FMN），而FMN被还原成FMNH2，FMNH2把1对H+ 释放到膜间隙，同时将1 对电子经铁硫蛋白（FeS）传给靠近内膜内侧的2个辅酶Q。每个辅酶Q先自复合物Ⅲ中的细胞色素b获得1个电子，并从基质中摄取1个H+，而被还原为半醌（QH），QH再接受从复合物Ⅰ传递来的1个电子，同时又从基质中摄取1个H+，形成氢醌（QH2）。QH2通过构象改变移动到内膜外侧时，先后向膜间隙释放2个H+，同时，QH2的2个电子中的1个先交还给细胞色素b；另外1个电子经FeS传给细胞色素c1，细胞色素c1又将电子传递给内膜外缘的细胞色素c，辅酶Q则从内膜外侧回到内侧，完成Q循环（Q Cycle）。因此，通过Q循环，每传递1个电子，就有2个H+ 被泵到膜间隙。细胞色素c在膜间隙扩散，将电子传递给复合物Ⅳ，基质侧的H+ 可通过复合物Ⅳ的质子通道又回到膜间隙，复合物Ⅳ的aa3将电子传给1/2O2使生成O2-而与基质中的2个H+结合生成水。由此可见，电子在传递过程中，不断有H+从线粒体基质中抽提至膜间隙。由于线粒体内膜对H+ 又不能自由通过，造成了H+ 浓度的跨膜梯度，并使原有的外正内负的跨膜电位差增高，H+ 浓度梯度和跨膜电位就共同构成了质子动力势，质子动力势推动H+ 通过ATP合成酶装置进入基质，每进入2个H+ 可驱动合成1个ATP分子。 根据化学渗透假说，电子及质子通过呼吸链上电子载体和氢载体的交替传递，在线粒体内膜上形成３次回路，导致3对H+ 由基质抽提至膜间隙，生成3个ATP分子。化学渗透假说有两个特点：一是强调线粒体膜结构的完整性。如果膜不完整，H+ 便能自由通过膜，则无法在内膜两侧形成质子动力势，那么氧化磷酸化就会解偶联。一些解偶联剂的作用就在于改变膜对H+ 的通透性，从而使电子传递所释放的能量不能转换合成ATP。二是定向的化学反应。ATP水解时，H+从线粒体内膜基质侧抽提到膜间隙，产生电化学质子梯度。ATP合成的反应也是定向的，在电化学质子梯度推动下，H+ 由膜间隙通过内膜上的ATP合成酶进入基质，其能量促使ADP和Pi合成ATP。虽然化学渗透假说得到了许多实验结果的支持。但目前也有不少科学家对化学渗透假说持有不同看法，随着研究工作的深入，得出了与其相矛盾的实验结果。如芬兰科学家Wikstrom（1980年）的实验表明，细胞色素氧化酶也有质子泵的作用。另外，有的科学家发现，一种细菌（Bacillus megaterium）变种，其细胞膜的质子梯度被解偶联剂解除后，仍能进行ATP合成。反之，有一些抑制剂能显著抑制氧化磷酸化作用，而△μH+ 却很少受影响。如果将ATP合成酶的F1不可逆地失活，ATP驱动的琥珀酸还原NAD的反应即受到抑制，但对△μH+ 却无任何影响。由此可见，这些结果难以用化学渗透假说来解释。因此，不断有人提出一些修正或新的假说来解释能量的转换机理，如Williams假说和Boyer的ATP合成酶的结合变化机制（binding change mechanism） 以及 Slater 提出的碰撞假说（collision hypothesis）等。近年来，随着结构生物学的深入研究，对ATP合成机制已有了进一步的认识。
 
ATP合成酶的作用机制
ATP合成酶的各种亚基是如何协同作用利用跨膜的质子梯度形成ATP，在ATP形成过程中ATP合成酶又是如何起作用等问题，一直是最具吸引力的研究课题之一，随着ATP合成酶三维结构研究的突破，现在这个奥秘已逐渐揭开。最近许多实验结果表明，ATP合成酶可能是已发现的自然界最小的分子马达，其运转效率几乎达100％。美国生物化学家Boyer提出的ATP合成酶的结合变化和旋转催化机制最近得到最新实验证据的支持。ATP合成酶与核苷酸的结合是按照结合变化机制（binding change mechanis）进行的，即在任一时刻，F1上3个β催化亚基的构象总是不同的，与核苷酸结合也不一样，每个催化位点与核苷酸的结合按顺序经过三种构象状态：紧密结合态（T态）、松散结合态（L态）和空置状态（不与任何核苷酸结合的O态）。在ATP合成过程中，3个β催化亚基的构象发生顺序变化，每一个催化亚基要经过3次构象改变才催化合成1个ATP分子。这样较好地表示了β亚基构象交替变化与底物结合和H+ 转运之间的关系。ADP和Pi与β2结合，在较少能量变化情况下，ADP与Pi自发地形成ATP；在质子流推动下，α3β3亚基相对于“转子”旋转120o，3个β亚基随即发生构象改变，使β亚基对ATP、ADP和Pi的亲和力产生变化，从而引起ATP从β2上释放出来，空出的结合位点又可与新的ADP和Pi结合。由此看出，结合变化机制主要涉及的是3个β催化亚基在合成或水解ATP过程中的构象变化，其构象变化由“转子”的转动来实现。转子相对于α3β3亚基旋转周期时间为100 ms,这与F1水解ATP的速率是相同的。ATP合成酶是如何催化合成ATP的，目前认为是按照“旋转催化（rotational catalysis）”的模式进行的。在大肠杆菌ATP合成酶中，发现H+ 通过F0的转运需要a、b、c 3种亚基参与，a亚基至少含有5个跨膜α螺旋，其第四个α螺旋上的Arg210被认为是H+ 转运所必需的；b亚基是单跨膜亚基，有一个很长的亲水头部；c亚基有两个跨膜α螺旋和一个突出于胞质侧的发夹结构，其第2个α螺旋上的Asp61被认为是H+ 结合位点，其质子化/去质子化循环可以转运H+。ATP的合成和H+ 的转运偶联的具体过程有可能是按下述方式进行：（1）F0的a亚基Arg210和c亚基Asp61产生瞬间的盐桥，使c亚基Asp61从高PKa态变成较低Pka态，此时，H+ 在跨膜质子动力势推动下进入F0，与c亚基结合，导致c亚基构象发生变化，c亚基极性环旋转，同时与γε亚基结合；（2）a亚基与c亚基解聚，c亚基Asp61重新回到高Pka态，Asp61的羧基移向基质铡，H+ 从61位的Asp中释放出来，同时c亚基极性环与γε亚基解离。γε与F0的a或b亚基的非对称性结合，使γε按一定方向（顺时针或逆时针）与下一个低Pka态的c亚基极性环结合；F0上H+ 的转运积累足够的扭力矩时，推动γε相对于α3β3旋转120o，而γε通过与β亚基核苷酸结合位点的作用使β（ATP）亚基释放一个ATP分子。但旋转催化假说的真正阐明并被接受还是在获得ATP酶的晶体结构并设计了一些非常具有说服力的实验之后。1994年Walker等发表了0.28nm分辨率的牛心线粒体F1-ATP酶的晶体结构。这是目前在原子分辨率解出的最大的具有不对称结构的蛋白质，为Boyer提出的结合变化和旋转催化机制提供了结构基础，他也因此与Boyer分享了1997年的诺贝尔化学奖。根据Walker等的报道，可以清楚地看到F1-ATP酶象桔子一样的扁圆球体，高8nm，宽10nm，α和β亚基象桔子瓣一样的绕Υ亚基的Ｃ末端（Υ209-272）形成的9nm长的中心α螺旋交替排布。α螺旋C末端残基在顶部的表面插入约1.5nm的凹槽，此螺旋的底部与Υ1-45形成的第二个螺旋为左手反平行的螺旋结构，此螺旋结构相对颈的底部突出大约3nm，是ATP酶的4.5nm主颈的一部分。从晶体结构可观察到ATP酶的3个催化亚基由于结合的核苷酸底物不同，而呈现不同的构象，有力地支持Boyer提出的结合变化机制，证明在催化循环的任一时刻，3个催化亚基处于不同的构象状态，不同构象的转化与位于α3β3中央的γ亚基的转动运动相关。Noji等利用线粒体F1-ATP酶的晶体结构研究的结果，精心设计了一系列的标记、突变，并采用最新的荧光显微镜摄像技术，将γ亚基的转动运动展显出来，这个结果清楚地表明，γ亚基是在α3β3形成的圆筒中转动的，转动是单方向反时针进行的。转动使中心的γ亚基能够与三个β亚基按顺序由空位、ADP结合位到AMP-PNP结合位发生接触，这个顺序正好与预言的ATP水解反应从ATP→ADP→空位点的转动顺序一致。这个实验使我们清楚地看到F1-ATP酶确实是一个分子马达，证明了旋转催化假说的正确性。经过20多年的实验研究，终于证实了Boyer早期提出的设想：当H+ 流跨膜转运时，带动ATP合成酶基部的类车轮结构和与之连接的轴进行转动，就象水流带动水轮机一样。这一转动继而引起与轴相连的三个叶片（即3个β亚基）发生一定的构象变化，结果使ADP和Pi合成ATP分子并将其释放出来。形象地刻画出ATP合成酶的催化循环犹如一部精密的分子水轮机。
 
线粒体与疾病
线粒体是细胞内最易受损伤的一个敏感的细胞器，它可显示细胞受损伤的程度。许多研究工作表明，线粒体与疾病、衰老和细胞凋亡有关，线粒体的异常会影响整个细胞的正常功能，从而导致病变。有人将这一类疾病称为“线粒体病”（Mitochondrial Diseases，MD）。当然，很多疾病的病变也可引起细胞内线粒体产生继发性的变化，如肝癌细胞线粒体内的已糖激酶活性明显高于正常细胞。“线粒体病”是指那些在病变细胞内较早出现的线粒体极为明显异常的病理变化。克山病就是一种“心肌线粒体病”（mitochondrial cardiomyopathy）。它是以心肌损伤为主要病变的地方性心肌病，因营养缺乏（缺硒）而引起，线粒体硒含量明显降低，慢性者为正常量的1/2，亚急性者为正常量的12.5％。硒对线粒体膜有稳定作用，患者因缺硒而导致心肌线粒体出现膨胀、嵴稀少和不完整；琥珀酸脱氢酶、细胞色素氧化酶和H+-ATP酶活性及其对寡霉素的敏感性都有明显降低；膜电位下降，膜流动性减低；对电子传递和氧化磷酸化偶联均有明显影响。随着研究工作的不断深入，发现细胞中线粒体的数量随年龄增长而减少，而体积却随年龄增长而增大。在膨大的线粒体中有时可见其内容物网状化而呈多囊体。同时“线粒体病”的研究已与线粒体DNA（mtDNA）的损伤、缺失相联系，随着年龄的增长，损伤mtDNA的积累愈来愈多，有实验证明，在心或脑中缺失7.4kb或5.0kb片段的mtDNA的含量随年龄增长有明显增加。人脑部区域mtDNA损伤程度63～77岁比24岁的增长14倍，80岁又比63～77岁的增大4倍。目前已知的100多种人类线粒体疾病，其原发机制都是mtDNA异常（突变、缺失、重排）引起的遗传性疾病，表现为呼吸链的电子传递酶系和氧化磷酸化酶系的异常。有些学者认为，线粒体是细胞内自由基的源泉，它们是决定细胞衰老的生物钟，机体95％ 以上的氧自由基都来自线粒体的呼吸链，电子传递过程中的单电子漏给分子氧是氧自由基（和过氧化氢）等活性氧生成的主要原因，复合体Ⅰ和Ⅲ是其产生的主要部位，Q循环反应中的QH或还原性细胞色素b556是单电子漏出的主要电子供体。正常情况下，氧自由基可被线粒体中的Mn2+-SOD所清除，机体衰老及退行性疾病时Mn2+-SOD活性降低，氧自由基积累在线粒体中，据估计，因生物氧化而产生的氧自由基，其氧化损伤的mtDNA的积累量可比核DNA高16倍，而且因损伤的mtDNA的复制又较完整的mtDNA要快得多。这样，经过一定时间的累积就会导致线粒体内膜参与能量转换的酶系功能异常。近年来，Gummings等人发现真菌细胞的线粒体中存在衰老DNA，很可能它会抑制mtDNA的复制，从而导致线粒体结构与功能的破坏，引起细胞衰老和死亡。此外，线粒体还与细胞凋亡有关。1995年Wang等人发现各种凋亡诱导因子诱发细胞凋亡后，胞质中细胞色素c含量增加。进一步研究还发现，只有成熟的细胞色素c（holocytochrome c）才有引起细胞凋亡的作用，而在胞质中内质网核糖体合成的细胞色素c前体（apocytochrom c）则无此作用，亦即只有线粒体释放的细胞色素c才有凋亡作用。这表明线粒体是通过释放细胞色素c参与细胞凋亡的。